细胞核DNA/线粒体DNA双提试剂盒

产品货号：

KL2212172

中文名称：

细胞核DNA/线粒体DNA双提试剂盒

英文名称：

Culture Cells Nuclear DNA and Mitochondrial DNA Purification Kit

产品规格：

25T

发货周期：

1～3天

产品价格：

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简要说明：

本试剂盒基于沉淀法，用于对培养细胞细胞核DNA和线粒体DNA提取，提取得到的DNA可直接用于PCR、酶切、杂交等实验。

产品特点：

产品组成：

保存：按标签指示条件保存，有效期1年。

用户自备：
无水乙醇，75%乙醇，PBS缓冲液，胰酶溶液。

使用方法：
一、实验前准备

二、细胞核粗提

培养细胞：将覆盖率为55～65%的培养细胞用自备的胰酶溶液按标准的胰酶法处理，然后刮到1.5mL塑料离心管中，4℃ 600×g离心3分钟，小心弃上清。细胞数量最好在10⁵～10⁷个。细胞沉淀体积约0.1mL。
用1mL自备的预冷的PBS缓冲液重悬细胞沉淀并计数，转移10⁵～10⁷个细胞到离心管中，然后4℃ 600×g离心3分钟，小心弃上清。
必须尽快用PBS缓冲液洗涤细胞沉淀，否则沉淀细胞产生的二氧化碳将使局部pH减低产生毒性。
在细胞沉淀中加入1mL动物细胞溶胀液，用手指轻柔弹管壁使细胞沉淀悬浮起来。最好不要用枪头。
冰浴10分钟。如果有条件可以取少量样品涂片，在显微镜下观察，90%的细胞将呈现气球状。如果没有则继续冰浴直到90%的细胞呈现气球状。
涡旋激烈震荡10～30秒混匀。如果有Dounce玻璃匀浆器，也可以用预冷的匀浆器匀浆10～12次。如果有条件可以取少量样品涂片，在显微镜下观察，90%的细胞将破裂。未破裂未膨胀且折光度高的是死细胞。如果死亡的细胞太多，则需要重新取样。
4℃ 1000×g离心3分钟，小心收集上清。沉淀为细胞核，上清为含线粒体胞浆。将细胞核沉淀放置冰上，和即将准备好的线粒体一起用于DNA提取，也可以放置在-20℃待用。

三、线粒体粗提

四、DNA的提取（下面步骤为细胞核DNA提取和线粒体DNA提取通用）

在细胞核或线粒体沉淀中加入0.5mL DNA提取溶液A，用移液枪吹打数次混匀后再加入75μL DNA提取溶液B，混匀后于55℃温育10分钟。注意溶液将成浑浊状。
再加入0.2mL DNA提取溶液C充分颠倒混匀。
在4℃下13000×g离心20分钟后，将上清（含DNA）转入一新的1.5mL塑料离心管中。
重复11～12步一次。
加入两倍体积的自备无水乙醇充分震荡混匀后，室温13000×g离心5分钟，去尽上清。
加入1mL自备的75%乙醇，充分混匀后室温13000×g离心5分钟，去尽上清。
重复上步一次。
短暂离心，去尽残留溶液（此步十分重要，不要省略）。
短暂晾干半分钟，加入适量DNA洗脱液溶解DNA，对细胞核DNA，可加入500μL DNA洗脱液，对线粒体DNA，可加入50μL DNA洗脱液。
65℃保温15分钟以便彻底溶解DNA沉淀。溶解后的DNA可以立即用于后续的OD检测、酶切、PCR或其他实验，也可以放置在-20℃长期保存。

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